詳談各種酶活檢測方法

通常酶制劑活性的檢測是采用實(shí)驗(yàn)室分析手段來進(jìn)行評價(jià)，它可以用來篩選酶制劑、確定復(fù)合酶制劑的zui佳組方及確定產(chǎn)品的zui佳添加量等，酶制劑實(shí)驗(yàn)室評價(jià)技術(shù)是目前飼料廠家應(yīng)用zui為廣泛的一種方法。其操作相對簡單，檢測所用時(shí)間短，便于生產(chǎn)實(shí)踐應(yīng)用。酶活測定結(jié)果雖不能*反映酶的使用效果，但通過檢測至少可以避免使用劣質(zhì)的酶制劑。我國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中已經(jīng)確立了飼用植酸酶（GB/T 18634）、纖維素酶（NY/T912）、β-葡聚糖酶（NY/T 911）的測定方法。另外，許多企事業(yè)單位為了生產(chǎn)研究的需要也制定了很多用于各種酶制劑活力的測定方法。目前測定酶制劑活性的方法主要有：

1, 比色法

    比色法是以反應(yīng)生成有色化合物的顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法，根據(jù)原理不同可分為還原糖法和色原底物法。

2, 還原糖法    這種方法是通過酶作用于化學(xué)合成或從自然界提取出來的底物來進(jìn)行測定的。非淀粉多糖酶與底物在特定的條件（溫度、pH值和底物濃度）下反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物為還原糖，在與顯色劑反應(yīng)后，通過比色確定還原糖的生成量，同時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶的活性表示為單位時(shí)間產(chǎn)生一定濃度的產(chǎn)物所需要的酶量（mg 或mL）。該法可適用于大部分酶活力的測定，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、木聚糖酶、果膠酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶等的測定。根據(jù)顯色劑的不同又可分為DNS 法、釩鉬酸銨法和地衣酚法。其中DNS 法由于操作簡單、顯色穩(wěn)定，是目前眾多實(shí)驗(yàn)室和飼料企業(yè)在測定非淀粉多糖酶時(shí)應(yīng)用zui多的測定方法。

3, 色原底物法    原理是利用人工合成的含色原基團(tuán)的底物在酶的作用下釋放出有色物質(zhì)，利用分光光度計(jì)比色測定有色物質(zhì)的含量計(jì)算酶活。如木聚糖酶活力的測定。該法操作簡單、重現(xiàn)性好，但酶作用于合成底物與天然底物的效果有一定區(qū)別，用合成底物測定的酶活并不能代表酶制劑在應(yīng)用于天然飼料時(shí)所能發(fā)揮的酶活大小。

4,  黏度法

    這種方法是根據(jù)酶能夠降低一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)底物（控制pH值、溫度等條件）的黏度的能力來確定酶的活性。利用的底物主要有化學(xué)合成的底物（如CMC 用于纖維素酶的測定） 和自然提取的底物（如小麥阿拉伯木聚糖用于木聚糖酶的測定）。測定的酶的活性值是通過與同時(shí)測定的標(biāo)準(zhǔn)酶活性的比較，來確定酶的活性。該法可用于木聚糖酶、β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶等酶活測定。這種方法的特點(diǎn)是通過降低底物的粘度來反映酶的活性，這也正是酶在體內(nèi)起作用的重要特征。該法雖然靈敏度較高，但重現(xiàn)性差，操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，應(yīng)用難于普及。

5,  免疫學(xué)法

    用于酶活性分析的免疫學(xué)法包括ELISA 法和免疫凝膠擴(kuò)散法。這兩種方法是根據(jù)酶與抗體之間發(fā)生反應(yīng)，然后ELISA 法通過第二步反應(yīng)，凝膠擴(kuò)散法則通過印染過程來確定酶的活性。

    這些方法非常靈敏，能夠檢測到極低水平的酶蛋白。但它們的缺點(diǎn)是對于每個(gè)產(chǎn)品的酶需要特殊的抗體，另外抗體能夠與非酶蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。由于抗體本身所用的蛋白質(zhì)是特定的，因此，由不同生產(chǎn)者生產(chǎn)的同種類型的酶之間是沒有交叉性的。另外，采用實(shí)驗(yàn)動物的敏感性也值得探討。

6,  凝膠擴(kuò)散法

    這種方法是將酶作用的底物與某種凝膠混合后倒入培養(yǎng)皿中，凝固之后，在凝膠上切開一條鑿，倒入標(biāo)準(zhǔn)酶液和測試酶液。培養(yǎng)一定時(shí)間后，在切開的凝膠周圍能夠看到水解區(qū)域，區(qū)域的大小與酶的含量成正比。在某些情況下，還可以再加入其他試劑來顯示水解的區(qū)域。如木聚糖酶活力的測定。    這種方法雖然簡單，但培養(yǎng)時(shí)間長。因?yàn)檫@種方法是根據(jù)區(qū)域的大小來確定酶的活性，所以其準(zhǔn)確性要低于其他非擴(kuò)散的方法。

7,  比濁法

    以酵母或酵母細(xì)胞壁在緩沖溶液中的濁度或吸光度的降低來表示酶活力，如β-葡聚糖酶活力的測定。

8,體外模擬消化技術(shù)

    酶活測定畢竟不能反映外源酶在機(jī)體內(nèi)真實(shí)的作用效果，因此，對于體外法評定飼料營養(yǎng)價(jià)值的研究不斷增加。體外法評定飼料營養(yǎng)價(jià)值是通過模擬消化道內(nèi)溫度、pH、消化酶分泌、胃腸運(yùn)動和養(yǎng)分吸收等參數(shù)，在體外建立一套與畜禽消化道內(nèi)環(huán)境接近的操作程序，對飼料及酶制劑進(jìn)行營養(yǎng)價(jià)值預(yù)測和評定。常用的體外模擬消化技術(shù)包括：①胃蛋白酶—胰酶法；②胃蛋白酶—小腸液法；③胃蛋白酶—胰酶—瘤胃液法；④胃蛋白酶—胰酶—碳水化合物酶法。

    由于不同的飼料用酶是不同的微生物通過發(fā)酵過程產(chǎn)生的，酶產(chǎn)品的酶學(xué)性質(zhì)差別較大。并且各種微生物所分泌的酶的zui佳pH 值、溫度和對底物的親和性都不相同。而目前，飼用酶除植酸酶、纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶有正式頒布的國標(biāo)或行標(biāo)酶活測定方法外，其他飼用酶制劑目前都還沒有一個(gè)統(tǒng)一的定義及檢測標(biāo)準(zhǔn)。因此，飼料廠家在比較不同廠家的酶制劑時(shí)，在沒有統(tǒng)一的測定方法情況下，應(yīng)首先確定自己認(rèn)可的檢測方法，然后在*相同的測定條件進(jìn)行檢測，這樣得出的結(jié)論才具有可比性。